移植を前提としたヒト培養組織生産プロセスの開発　

　移植治療の分野において，近年，細胞をin vitroで培養し，その後，組織や臓器へと分化させ，最終的には患者へ移植・再構築させる治療法が研究されている．しかし，現在のところ，生化学，発生医学的な質的改善に対する研究は盛んであるものの，培養皮膚の生産方法などの培養工学的見地からの研究は少ない．本研究テーマでは，角化細胞の皮膚組織への3次元再構築を実現できる完全自動化培養リアクターの開発を最終目的として，まず基礎的な増殖速度および細胞内の物質移動の速度論的解析を行い，さらに小スケールにおいて，皮膚組織の3次元的に再構成させるためのリアクターの構築を目指している．

特に，表皮シートを生産・移植する際（図参照），患者から表皮の組織片（バイオプシー）を最小必要量（表皮シート生産の場合では約1cm2）を採取する．その組織片から角化細胞を酵素処理により分離して，小型の培養容器（25cm2のT-フラスコ）に細胞を接種し，初代培養を行う．付着細胞である角化細胞は培養容器内で単層状態で増殖する．細胞が培養容器の培養面をほぼ全面を覆った時（コンフルエント），細胞を酵素処理により培養面から剥離して再懸濁し，細胞数を増やすために，数個の広めの培養容器（75cm2のT-フラスコ）にて単層に増殖させる継代培養を行う．その際，細胞寿命による継代の限界が存在するため，継代培養を適当回数繰返し，充分な細胞を得た後，組織培養を行う．組織培養においては，細胞を単層で増殖させ，コンフルエント後も培養を続けて，自己組織化（分化）を引き起こし，多層化させる．この角化細胞が多層化した培養表皮組織は，構造的に強く，酵素処理によって，培養容器からシート状で剥離することができる．剥離された培養組織（表皮シート）を，患者の患部に被覆移植を施して治癒を目指す．

これら一連の操作を工学的観点から見ると，患者自身の表皮細胞培養を受託し，移植用表皮シート（自家培養皮膚）を作製するテーラーメイド的な生産プロセスであるため，患者ごとに細胞特性（活性，寿命）が変化したり（原料の不均一性），患部の大きさが個々で変わるために（生産量と生産時間の変動），生産者側からは定量的評価に基づく情報の提供による安定した生産プロセスの構築が望まれている． しかし，これら一連の培養表皮シートの移植過程において，細胞特性の定量的評価が欠除しており，有効な指標パラメータが存在しないのが現状である．さらに，医療側においても，移植の完成度に関する定量的評価が不明確で，移植効果の数値化が望まれている．

我々は，工学的基礎として，細胞の最適な培養条件を検索するため継代培養中に見られる種々の生物的現象（細胞接着，増殖，分化，細胞寿命など）を，適切で合理的な培養操作を可能とするプロセスパラメータで整理する（動物細胞に固有な培養パラメータの策定と組織生産プロセスへの適用）．さらに，組織内の増殖因子，酸素，無機イオンの物質移動を解析し，これらの組織内移動現象や細胞外マトリックスの発現メカニズムを解明する．また，個々の細胞増殖から組織再構築までを俯瞰した細胞の増殖・分化・組織化に関する速度論的解析を行い，三次元的に組織を再構成させるための培養条件の最適化を行う（培養平面または立体空間における細胞増殖過程評価（増殖シミュレータ））．得られた結果をもとに培養容器を開発し，また，増殖過程のモニタリングツールや組織内での細胞分布シミュレーターを具備し，細胞の動態を常時監視するだけではなく，雑菌汚染等のアクシデントにも対応しうる培養リアクターシステムを構築する（足場依存性細胞の培養リアクターの構築）．さらに，一連の培養を自動的に行う生産プロセスを構築するため，細胞の付着面からの剥離および再接着の制御を行うことによる培養操作の自動化を実現するとともに，細胞量変化のオンライン測定と知的制御等のコンピュータシミュレーション技術を統合することにより，培地交換，培養停止等の時間的最適化を図る（培養組織生産プロセスの自動化）．これらの結果をもとに製品の出荷日予測などのスケジューリングとデリバリーシステムにおける品質管理を統合し，培養組織の高品質化，医療現場における治療方針，手術日の設定等の治療設計に貢献する（品質評価システムの構築）． 本研究は，治療前におおよその治療結果（治療の終了時期や患部の治癒程度）が予測できる治癒予測システムの構築および臨床指針の確立を目指しており，将来的にも重要で継続性の高い課題であると考えている．  

（追加の概念図など）

主な研究内容(研究の現状) 　参考資料（pdfファイル）

·  足場依存性細胞の培養リアクターの構築

·  培養組織生産プロセスの自動化

·  培養平面または立体空間における細胞増殖過程評価（増殖シミュレータ）

·  動物細胞に固有な培養パラメータの策定と組織生産プロセスへの適用

本分野の業績(H19.1まで)

受賞

日本動物細胞工学会2003年度大会(JAACT2003) 優秀賞（応用研究部門）
（2003年6月27日）
Po.20 ｢細胞挙動観察に基づく培養環境の制御｣
阿潟浜由香，幡多徳彦，紀ノ岡正博，田谷正仁  p.54

 

日本生物工学会第26回照井賞（平成15年度，生物化学工学）（2003年9月16日）
「移植を前提としたヒト培養組織生産に関する生物化学工学的研究」

 

化学工学会化学工学論文集「2004年度優秀論文賞」（2005年3月4日）
化学工学論文集30巻4号, pp.515-521, 2004
「軟骨細胞のコラーゲンゲル包埋培養を対象とした3次元増殖モデル」
屋敷思乃，原由之，紀ノ岡正博，田谷　正仁

 

平成17年度化学工学会研究賞（2006年3月29日）
「移植用細胞・組織の培養生産に関するバイオプロセス工学的研究」
田谷正仁，紀ノ岡正博

 

論文

Masahiro Kino-oka and Jiri E. Prenosil: “Growth of Human Keratinocytes on Hydrophilic Film Support and Application to Bioreactor Culture,” J. Chem. Eng. Japan, Vol.31, No.5, pp.856-859 (1998).

Veronika Slonkova, Masahiro Kino-oka, Sabina Mazza, Carmen Nievergelt, Jiri E. Prenosil, Günter Burg and Jürg Hafner: “Cultured Epithelial Autografts for the Management of a Chronic Pretibial Leg Ulcer due to Congenital Valvular Aplasia”, Dermatology, Vol.198, No.1, pp.101-103 (1999).

Masahiro Kino-oka and Jiri E. Prenosil: “Development of On-Line Monitoring System of Human Keratinocyte Growth by Image Analysis and Its Application to Bioreactor Culture”, Biotechnol. Bioeng., Vol.67, No.2, pp.234-239 (2000).

Masahiro Kino-oka, Ryota Umegaki, Masahito Taya, Setsuji Tone and Jiri E. Prenosil: “Valuation of Growth Parameters in Monolayer Keratinocyte Culture Based on a Two-Dimensional Cell Placement Model”, J. Biosci. Bioeng., Vol.89, No.3, pp.285-287 (2000).

Shino Yashiki, Ryota Umegaki, Masahiro Kino-oka and Masahito Taya: “Evaluation of Attachment and Growth of Anchorage-Dependent Cells on Culture Surfaces with Type I Collagen Coating”, J. Biosci. Bioeng., Vol.92, No.4, pp.385-388 (2001).

Ryota Umegaki, Koji Murai, Masahiro Kino-oka and Masahito Taya: “Correlation of Cellular Life Span with Growth Parameters Observed in Successive Cultures of Human Keratinocytes”, J. Biosci. Bioeng., Vol.94, No.3, pp.231-236 (2002).

Hiroyuki Hirai, Ryota Umegaki, Masahiro Kino-oka and Masahito Taya: “Characterization of Cellular Motions through Direct Observation of Individual Cells at Early Stage in Anchorage-Dependent Culture”, J. Biosci. Bioeng., Vol.94, No.4, pp.351-356 (2002).

梅垣良太，紀ノ岡正博，田谷正仁:“トリプシンおよびトリプシンインヒビター処理を伴うヒト角化細胞の継代培養操作”, 化学工学論文集, Vol.29, No.3, pp.432-438, (2003).

Ryota Umegaki, Masahiro Kino-oka and Masahito Taya: “Assessment of Cell Detachment and Growth Potential of Human Keratinocyte Based on Observed Changes in Individual Cell Area during Trypsinization”, Biochem. Eng. J., Vol.17, No.1, pp.49-55 (2004).

Norihiko Hata, Koji Murai, Masahiro Kino-oka and Masahito Taya: “Acute Responses of Cell Individuals Observed after Calcium Administration in Human Keratinocyte Culture”, Biochem. Eng. J., Vol.18, No.2, pp.155-158 (2004).

Norihiko Hata, Mee-Hae Kim, Katsuhiro Isoda, Masahiro Kino-oka, Masaya Kawase, Kiyohito Yagi and Masahito Taya: “Dendrimer-Immobilized Culture Surface as a Tool to Evaluate Formation of Cellular Cytoskeleton of Anchorage-Dependent Cells”,  J. Biosci. Bioeng., Vol.97, No.4, pp.233-238 (2004).

Masahiro Kino-oka, Yuka Agatahama, Norihiko Hata and Masahito Taya: “Evaluation of Growth Potential of Human Epithelial Cells by Motion Analysis of Pairwise Rotation under Glucose-Limited Condition”, Biochem. Eng. J., Vol.19, No.2, pp.155-158 (2004).

Norihiko Hata, Hiroyuki Hirai, Masahiro Kino-oka and Masahito Taya: “Comprehension of Attachment and Multiplication Properties by Observing Individual Cell Behaviors in Anchorage-Dependent Culture”, Biochem. Eng. J., Vol.20, No.2-3, pp.197-202 (2004).

屋敷思乃，原由之，紀ノ岡正博，田谷正仁: “軟骨細胞のコラーゲンゲル包埋培養を対象とした3次元増殖モデル”, 化学工学論文集, Vol.30, No.4, pp.515-521 (2004).

Masahiro Kino-oka, Yoshikatsu Maeda, Takeyuki Yamamoto, Katsura Sugawara, and Masahito Taya: “A Kinetic Modeling of Chondrocyte Culture for Manufacture of Tissue-Engineered Cartilage”, J. Biosci. Bioeng., Vol.99, No.3, 197-207 (2005).

Masahiro Kino-oka, Natsuki Ogawa, Ryota Umegaki and Masahito Taya: “Bioreactor Design for Successive Culture of Anchorage-Dependent Cells Operated in an Automated Manner”, Tissue Eng., Vol.11, No.3-4, 535-545 (2005).

Masahiro Kino-oka, Shino Yashiki, Yuka Ota, Yuko Mushiaki, Katsura Sugawara, Takeyuki Yamamoto, Toshiaki Takezawa and Masahito Taya:“Subculture of Chondrocytes on a Collagen Type-I Coated Substrate with Suppressed Cellular Dedifferentiation”, Tissue Eng., Vol.11, No.3-4, 597-608 (2005).

Masahiro Kino-oka, Yoshikatsu Maeda, Yuka Ota, Shino Yashiki, Takeyuki Yamamoto, Katsura Sugawara, and Masahito Taya: “Process Design of Chondrocyte Cultures with Monolayer Growth for Cell Expansion and Subsequent Three-Dimensional Growth for Production of Cultured Cartilage”, J. Biosci. Bioeng., Vol.100, No.1, pp. 67-76 (2005).

Masahiro Kino-oka, Yuka Agatahama, Yuki Haga, Masukazu Inoie, Masahito Taya: “Long-Term Subcultures of Human Keratinocytes under an Anoxic Condition”, J. Biosci. Bioeng., Vol.100, No.1, pp.119-122 (2005).

Norihiko Hata, Yuka Agatahama, Masahiro Kino-oka, and Masahito Taya: “Relations between Individual Cellular Motions and Proliferative Potentials in Successive Cultures of Human Keratinocytes” , Cytotechnology, Vol.47，No.1-3, pp.127 - 131 (2005).

Masahiro Kino-oka, Natsuki Ogawa , Koji Murai, Masafumi Manabe , Masahito Taya: “Monitoring of Monolayer and Multilayer Growth for Epithelial Sheet Formation”, Biochem. Eng. J., Vol.32，No.1, pp.49-55 (2006).

Hideki Mori, Kazuaki Ninomiya, Masahiro Kino-oka, Tomoko Shofuda, Mohammed Omedul Islam, Mami Yamasaki, Hideyuki Okano, Masahito Taya, Yonehiro Kanemura: “Effect of Neurosphere Size on the Growth Rate of Human Neural Stem/progenitor Cells”, J. Neurosci. Res.,Vol.84, No.8, pp.1682-1691 (2006).

Masahiro Kino-oka, Yoshiki Morinaga, Mee-Hae Kim, Yoshinori Takezawa, Masaya Kawase, Kiyohito Yagi, and Masahito Taya: “Morphological Regulation of Rabbit Chondrocytes on Glucose-Displayed Surface”, Biomaterials, Vol.28, No.9, pp.1680-1688  (2007).

Mee-Hae Kim, Masahiro Kino-oka, Masaya Kawase, Kiyohito Yagi, and Masahito Taya: “Response of Human Epithelial Cells on Culture Surfaces with Varied Roughnesses Prepared by Immobilizing Dendrimers with/without D-Glucose Display”, J. Biosci. Bioeng., in press (2007).

Hideki Mori, Kazuaki Ninomiya, Yonehiro Kanemura, Mami Yamasaki, Masahiro Kino-oka and Masahito Taya: “An Image Cytometry for Analyzing Regional Distribution of the Cells inside Human Neurospheres”, J. Biosci. Bioeng., in press (2007).

 

著書

Jiri E. Prenosil and Masahiro Kino-oka: “Computer Controlled Bioreactor for Large Scale Production of Cultured Skin Grafts”, Ann. N. Y. Acad. Sci., Vol.875, pp.386-397 (1999).

Masahiro Kino-oka, Setsuji Tone, Jiri E. Prenosil: “Establishment of On-Line Growth Monitoring in Human Keratinocyte Culture and Its Application to Bioreactor Culture”, Chemical Engineering Symposium Series 70 Biochemical Engineering and Bioseparation Engineering (Ed. by The Special Study Groups for “Biochemical Engineering and Bioseparation Engineering”), pp.34-38, The Soc. of Chem. Engrs. Japan, Tokyo (1999).

Masahiro Kino-oka, Hiroyuki Hirai, Ryota Umegaki and Masahito Taya: “Characterization of Growth Properties through Morphological Observation in Culture of Anchorage-Dependent Cells”, Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects Volume 12 (Ed. by S. Shirahata, K. Teruya and Y. Katakura)（Proc. of the Thirteen Annual Meeting of the Japanese Association for Animal Cell Technology (JAACT 2000)）, pp.121-126, Kluwer Academic Publishers (2002).

紀ノ岡正博，田谷正仁: “再生医療のための細胞培養システムの開発”,BME(日本エム・イー学会雑誌),Vol.16,No.2, pp.10-17 (2002).

大政健史，荻野千秋，小山純弘，上平正道，川瀬雅也，紀ノ岡正博，黒沢尋，酒井康行，新海政重，高木睦，山本進二郎，王碧昭: ティッシュエンジニアリングの展望　−再生医療関連の産業化動向・日米比較−，三恵社,名古屋 (2002).

紀ノ岡正博，田谷正仁: “ティッシュエンジニアリングにおけるモデリングとその利用”,バイオプロセスエンジニアリング(清水浩編), pp.89-99, シーエムシー出版,東京 (2002).

大政健史，小山純弘，上平正道，川瀬雅也，紀ノ岡正博，黒沢尋，酒井康行，新海政重，高木睦，寺田聡，原正之，棟方正信，，森山剛，八木清仁，山地秀樹，山本進二郎，王碧昭:再生医療実用化に向けた生物工学研究−米英および国内生物工学者の活動−，三恵社,名古屋 (2003).

紀ノ岡正博，田谷正仁: “ものづくりから見た再生医療―培養組織の生産―”,バイオサイエンスとバイオインダストリー,Vol.61,No.8, pp.554-555 (2003).

紀ノ岡正博: “移植を前提としたヒト培養組織に生産に関する生物化学工学的研究”,生物工学会誌,Vol.82,No.3, pp.95-100 (2004).

紀ノ岡正博:“スイッチを有する組織培養面　−細胞剥離制御可能な温度感受性ポリマー−”,化学,Vol.59,No.5, pp.6-7 化学同人,京都(2004)

Masahiro Kino-oka and Masahito Taya: “Development of Culture Techniques of Keratinocytes for Skin Graft Production”, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (Recent Progress of Biochemical and Biomedical Engineering in Japan II) (Ed. by T. Kobayashi), Vol.91, pp.135-169, Springer-Verlag, Berlin (2004).

紀ノ岡正博，田谷正仁:“組織培養における細胞評価”, 最近の化学工学56−先端医療における化学工学（化学工学会関東支部編）, pp.79-97, 化学工業社,東京(2004).

紀ノ岡正博．井家益和，田谷正仁:“継代培養におけるヒト角化細胞の寿命評価” ,生物工学会誌,Vol.83,No.9, pp.430-432 (2005).

Masahiro Kino-oka and Masahito Taya: “Design and Operation of Radial Flow Bioreactor for Reconstruction of Cultured Tissues”, Bioreactors for Tissue Engineering; Principles, Design and Operation (ed. By J. Chaudhuri and M. Al-Rubeai), 115-133, Springer, Netherlands (2005).

紀ノ岡正博，田谷正仁: “移植を前提とした組織培養工程における細胞評価”, 医工学治療，Vol.17, No.4, pp.203-206 (2005).

紀ノ岡正博,田谷正仁: “9.3 組織工学製品の製造”, バイオプロダクション（化学工学会バイオ部会編），pp.166-170，コロナ社, 東京 (2006.5.26).

Tomohiro Toyosawa, Satoshi Terada, Masahiro Sasaki, Hideyuki Yamada, and Masahiro Kino-oka: “Observation of Individual Cell Behaviors to Analyze Mitogenic Effects of Sericin, , Animal Cell Technology: Basic Applied Aspects Volume 12 (Ed. by S. IIjima and K. Nishijima)(Proc. of the Seventeenth Annual Meeting of the Japanese Association for Animal Cell Technology (JAACT), pp.155-161, Springer, Dordrecht (2006).